組織學(xué)/電子顯微鏡術(shù)

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組織學(xué)

組織學(xué)緒論
- 組織學(xué)研究方法

1、透射電鏡術(shù) 透射電鏡（transmission electron microscope,TEM）是以電子束穿透樣品（組織的超薄切片），經(jīng)聚合放大后，顯像于熒光屏上進(jìn)行觀察和攝片的。電鏡的放大倍數(shù)的分辨率比光鏡大得多，放大倍數(shù)為幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)倍，分辨率可達(dá)0.2nm。標(biāo)本制備較光鏡的更嚴(yán)格，新鮮組織切成小塊（lmm³），用戊二醛，多聚甲醛、四氧化鋨等固定，樹脂包埋，以超薄切片機(jī)切成厚50～80nm的超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛等重金屬電子染色后，置于電鏡下觀察，標(biāo)本在熒光屏上呈黑白反差的結(jié)構(gòu)影像。被重金屬浸染呈黑色的結(jié)構(gòu)，稱電子密度高（electron-dense）；反之，淺染的部分稱電子密度低（electron-lucent）,這種染色稱正染色（positive staining）。若被染結(jié)構(gòu)著色淺淡，而其周圍部分染成黑,是稱為負(fù)染色（negative stainning）。透射電鏡的電子槍加速電壓50～100kV，電子束穿透力低，近年制成加速電壓500kV以上的超高壓電鏡，電子束穿透力很強(qiáng)，可觀察0.5～10μm厚的切片，可觀察細(xì)胞內(nèi)骨架等的立體超微結(jié)構(gòu)。應(yīng)用電鏡觀察細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)本，稱電鏡細(xì)胞化學(xué)術(shù)（electron microscope cytochemistry）；電鏡觀察免疫細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)本，稱免疫電鏡術(shù)（immunoelectron microscopy）；電鏡與放射自顯影結(jié)合的方法稱電鏡放射自顯影術(shù)（electron microscopeautoradiography）。

2、掃描電鏡術(shù) 掃描電鏡（scanning electron microscope,SEM）是用于觀察組織表面的立體結(jié)構(gòu)的。組織塊經(jīng)固定后，置于真空鍍膜儀內(nèi)于燥，在標(biāo)本表面先后噴鍍一層碳膜和合金膜，即可置于鏡下觀察。掃描電鏡的景深長(zhǎng)，樣品表面的金屬膜可提高其導(dǎo)電性和圖像反差，在熒光屏上掃描成像，呈現(xiàn)富有立體感的表面圖像，如細(xì)胞表面的突起、微絨毛、纖毛及細(xì)胞的分泌與吞噬行為等（圖1－13）。

大鼠分離肝巨噬細(xì)胞粘著吞噬羊紅細(xì)胞掃描電鏡像

圖1－13大鼠分離肝巨噬細(xì)胞粘著吞噬羊紅細(xì)胞掃描電鏡像

M肝巨噬細(xì)胞，R羊紅細(xì)胞

冷凍蝕刻標(biāo)本制備示意圖

圖1－14 冷凍蝕刻標(biāo)本制備示意圖

細(xì)胞單位膜從中間層劈開示意圖

圖1－15 細(xì)胞單位膜從中間層劈開示意圖

3、冷凍蝕刻復(fù)型術(shù)和冷凍割斷術(shù)

冷凍蝕刻復(fù)型術(shù)（tfeeze etch replica）：是在透射電鏡下觀察組織或細(xì)胞斷裂面的金屬?gòu)?fù)制膜，顯示細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的立體影像。組織塊先經(jīng)甘油生理鹽水處理（防止形成冰晶）后投入液氮快速冷凍，在低溫下用鋼刀將樣品劈開，形成凹凸不平的斷裂面：－100℃真空下使斷裂面的冰晶升華，暴露不平整表面；在斷裂面上先后噴鍍一層合金膜和碳膜，用次氯酸等組織腐蝕掉；將反差的凸凹不平的金屬?gòu)?fù)型膜置于鏡下觀察（圖1－14）。此項(xiàng)技術(shù)尤適用研究生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如從單位膜的脂質(zhì)分子疏水端劈開（圖1－15），經(jīng)蝕刻鍍膜，鏡下可見質(zhì)膜斷裂面復(fù)型膜結(jié)構(gòu)狀態(tài)（圖1－16），其凹凸影像恰與實(shí)物相反。

小鼠腎近曲小管微絨毛冷凍蝕刻復(fù)型電鏡像

圖1-16小鼠腎近曲小管微絨毛冷凍蝕刻復(fù)型電鏡像 ×38300

MV微絨毛 E E面，P P面（白求恩醫(yī)科大學(xué)尹昕、朱秀雄教授供圖）

冷凍割斷術(shù)（freeze cracking）：是將固定組織包埋在樹脂內(nèi)，低溫下割斷，斷面噴鍍合金，在掃描電鏡下觀察斷面的立體構(gòu)型。該技術(shù)適于研究組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系，如肝細(xì)胞與肝血竇和膽小管的關(guān)系，腎小體的腎小囊與血管球的關(guān)系等（圖1－17）。

大鼠腎冷凍割斷掃描電鏡示腎小體

圖1－17 大鼠腎冷凍割斷掃描電鏡示腎小體

R腎小囊外表面，G血管球，T腎小管

（白求恩醫(yī)科大學(xué)尹昕、朱秀雄教授供圖）

4、電鏡X－射線顯微分析術(shù)X－射線顯微分析術(shù)（X-ray microanalysis）是研究細(xì)胞和組織內(nèi)元素的種類、分布和含量的新技術(shù)。它是利用高速電子束轟擊電鏡內(nèi)生物標(biāo)本的微小區(qū)域，使該區(qū)所含的元素發(fā)射了一定波長(zhǎng)的X－射線，通過檢測(cè)器對(duì)X－射線進(jìn)行波譜或能譜分析，即可測(cè)定微區(qū)內(nèi)元素的性質(zhì)、含量和分布。如測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Na、K、Ca、Fe、P、Cl等及某些微量元素的含量和分布變化，探討各種元素與細(xì)胞生理和病理的關(guān)系。