DNA重組技術
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DNA重組技術(DNA recombinant technology)，將不同來源的DNA片段共價整合到有復制功能的DNA中去的技術。又稱分子克隆。該重組的 DNA分子可在寄主細胞中復制、擴增，并轉錄表達出與該外源性DNA相應的信使RNA或蛋白質。
DNA重組技術的主要步驟是：
① 選擇并分離能攜帶外源性 DNA的載體。常用的DNA載體有細菌質粒(染色體外DNA)，或噬菌體DNA，如大腸桿菌質粒CoLEI及pBR322;λ噬菌體及M13噬菌體DNA等，它們都能插入(或整合)一定長度的外源性DNA片段，并能在寄主細胞中自我復制。
② 以限制性內(nèi)切酶特異性水解打開載體的雙鏈DNA，使之具有特定的序列末端。不同的限制性內(nèi)切酶能識別并水解打斷雙鏈 DNA中的特定序列處，如限制性內(nèi)切酶ECoRI能識別下列結構并加以水解切斷。
（打斷處）
↓
………GAATTC………
………CTTAAG………
↑
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③ 制備擬整合入質粒中的外源性DNA片段(即“目的基因”)，使其末端與上述經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的載體DNA末端，具有互補的序列結構，便于粘合。
④ 將該具有互補序列結構的外源性DNA片段，通過連接酶整合入載體DNA中。若載體是質粒，則在整合入外源性DNA片段后，仍重新連接成環(huán)狀質粒。
⑤ 將此重組DNA引入寄主細胞中，使其復制和擴增。常用的寄主細胞為大腸桿菌及酵母，近已發(fā)展到用高等植物細胞及哺乳動物細胞。這類寄主細胞業(yè)經(jīng)變異處理，使之喪失降解外源性DNA的能力。將載體DNA往氯化鈣及磷酸鈉處理，使成DNA-磷酸鈣微粒，就易被寄主細胞內(nèi)吞而轉染之。亦有用核內(nèi)注射法或高壓電膜擊穿法以引入載體DNA者。
⑥ 通過一定的方法篩選能復制此重組 DNA的細胞或菌落。篩選方法的基礎是質粒上含有抗藥性基因，或利用該菌對某營養(yǎng)素的依賴表型。將該篩選出來的細胞株克隆繁殖，即能不斷復制擴增大量的該外源性重組DNA。
1972年，D.A.杰克遜成功地從兩種不同生物來源的DNA（病毒SV40分子及λ噬菌體分子），合成了第一個重組DNA分子。1973年S.科恩等成功地使重組DNA分子在寄主細胞內(nèi)獲得表達。這為今后體外大規(guī)模生產(chǎn)某特種蛋白質的基因工程的發(fā)展奠定了基礎，使不少人體中含量極微而十分重要的蛋白質(如某些激素和因子)的生物合成，能體外實現(xiàn)，這對醫(yī)學和生物學的發(fā)展具有劃時代的意義。如人胰島素、干擾素、乙型肝炎疫苗等已可用重組 DNA技術大規(guī)模生產(chǎn)。許多臨床診斷用的特異性基因探針，也可通過DNA重組技術的擴增而獲得，從而使很多遺傳性疾病(如 β-地中海貧血等)及乙型肝炎等的診斷水平前進了一大步。試用重組DNA進行“基因治療”，將能補償某些病人對該基因的缺失，此項研究在轉基因動物中已實驗成功，應用前景誘人。
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