斑點(diǎn)雜交
| A+醫(yī)學(xué)百科 >> 斑點(diǎn)雜交 |
是指將待測(cè)的DNA變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜,NC膜）上，用已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，洗膜(除去未接合的探針)，放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測(cè)。
斑點(diǎn)雜交（Dot blot）是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。
（1）DNA斑點(diǎn)雜交：
①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。
②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每個(gè)樣品一般點(diǎn)μl(2~10μg DNA)。
④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>
（2）RNA斑點(diǎn)雜交：與上法類似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μl
DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。
（3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類似檢測(cè)細(xì)菌菌落的方法，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測(cè)，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測(cè)。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。
| 關(guān)于“斑點(diǎn)雜交”的留言： |  訂閱討論RSS
|
|
目前暫無留言 | |
| 添加留言 | |