電泳法
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【電泳法】是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其含量(%)的方法。
【分類】
● 1.紙電泳法
操作法 (1) 電泳緩沖液 枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)。取枸櫞酸 (C6H8O7.H2O)39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7.2H2O4.12g，加水4000ml，使溶解。
(2) 濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過(guò)夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干，備用。可按需要裁成長(zhǎng)27cm、寬18cm的濾紙，或根據(jù)電泳室的大小裁剪，并在距長(zhǎng)度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號(hào)備點(diǎn)樣用?！?/p>
(3) 點(diǎn)樣 有濕點(diǎn)法和干點(diǎn)法。濕點(diǎn)法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中，濕潤(rùn)后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液，每10μl,共3點(diǎn)，并留2個(gè)空白位置;干點(diǎn)法是將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干、再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次，直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕，本法適用于稀的供試品溶液。
(4) 電泳 于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒(méi)鉑電極，接通電泳儀穩(wěn)壓電源檔,調(diào)整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時(shí)45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點(diǎn)的位置。
(5) 含量測(cè)定 剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置面積相近的空白濾紙，剪成細(xì)條，分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時(shí)，用3號(hào)垂熔玻璃漏斗濾過(guò)，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定測(cè)定吸收度，并按吸收系數(shù)計(jì)算含量。
● 2.醋酸纖維素薄膜電泳法
操作法
(1) 醋酸纖維素薄膜 取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無(wú)光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夾于濾紙中，輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無(wú)光澤面向上,置電泳槽架上,經(jīng)濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。
(2) 點(diǎn)樣與電泳 于膜條上距負(fù)極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5％的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區(qū)帶距離以4～5cm為宜。
(3) 染色 電泳完畢，將膜條取下浸于氨基黑染色液中，2～3分鐘后，用漂洗液浸洗數(shù)次，直至脫去底色止止。
(4) 透明 將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中10～15分鐘，取出平鋪于潔凈的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度計(jì)上測(cè)定和作標(biāo)本長(zhǎng)期保存。
(5) 含量測(cè)定 未經(jīng)透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法測(cè)定，一般采用洗脫法或掃描法，測(cè)定各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)含量(1%)。
● 3.瓊脂糖凝膠電泳法
操作法
(1)制膠 取瓊脂糖約0.2g，加水10ml，置水浴中加熱使溶脹完全,加溫?zé)岬?a href="/w/%E9%86%8B%E9%85%B8" title="醋酸" class="mw-redirect">醋酸－鋰鹽緩沖液(pH3.0)10ml，混勻，趁熱將膠液涂布于大小適宜(2.5cm×7.5cm
或4cm×9cm)的玻板上，厚度約3mm，靜置，待凝膠結(jié)成無(wú)氣泡的均勻薄層，即得。
(2) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液的制備 照各藥品項(xiàng)下規(guī)定配制。
(3) 點(diǎn)樣與電泳 在電泳槽內(nèi)加入醋酸－鋰鹽緩沖液(pH3.0),將凝膠板置于電泳槽架上，經(jīng)濾紙橋浸入緩沖液。于凝膠板負(fù)極端分別點(diǎn)樣1μl，立即接通電源，在電壓梯度約30V/cm、電流強(qiáng)度1～2mA/cm的條件下，電泳約20分鐘，關(guān)閉電源。
(4) 染色與脫色 取下凝膠板，用甲苯胺藍(lán)溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景無(wú)色為止。
● 4.聚丙烯酰胺凝膠電泳法
操作法
(1)制膠 取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加脲2.9g使溶解，再加水4ml，混勻，抽氣趕去溶液中氣泡，加0.56％過(guò)硫酸銨溶液2ml，混勻制成膠液，立即用裝有長(zhǎng)針頭的注射器或細(xì)滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10cm×0.5cm)中,使
膠層高度達(dá)6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面，管底氣泡必須趕走，靜置約30分鐘，待出現(xiàn)明顯界面時(shí)即聚合完畢，吸去水層。
(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液的制備 照各藥品項(xiàng)下的規(guī)定。
(3)電泳 將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內(nèi)，每管加供試品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液50～100μl，為防止擴(kuò)散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚藍(lán)指示液1滴,也可直接在上槽緩沖液中加0.04％溴酚藍(lán)指示液數(shù)滴，玻璃管的上部用電極緩沖液充滿，上端接負(fù)極、下端接正極。調(diào)節(jié)起始電流使每管為1mA，數(shù)分鐘后，加大電流使每管為2～3mA，當(dāng)溴酚藍(lán)指示液移至距玻璃管底部1cm處，關(guān)閉電源。
(4)染色和脫色 電泳完畢，用裝有長(zhǎng)針頭并吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內(nèi)滑出，將膠條浸入稀染色液過(guò)夜或用染色液浸泡10～30分鐘，以水漂洗干凈，再用脫色液脫色至無(wú)蛋白區(qū)帶凝膠的底色透明為止。
(5)結(jié)果判斷 將膠條置燈下觀察，根據(jù)供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的色帶位置和色澤深淺程度進(jìn)行判斷。將清晰的膠條置雙波長(zhǎng)薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描并積分，由各組分的峰面積計(jì)算含量(1%)。
● 5.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法
操作法
(1)制膠 用30%丙烯酰胺溶液－分離膠緩沖液－20%十二烷基硫酸鈉溶液－10％過(guò)硫酸銨溶液（新鮮配制）-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分離膠液，灌入模具內(nèi)至一定高度（剩余體積留作制備濃縮膠用），用水封頂，聚合完畢，傾去水層。再用30%丙烯酰胺溶液-濃縮膠緩沖液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10％過(guò)硫酸銨溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成濃縮膠液，灌在分離膠上，插入樣品梳（如為圓盤電泳，用水封頂），待濃縮膠液聚合后，小心除去樣品梳或水。
(2)對(duì)照品和供試品溶液的制備 照各藥品項(xiàng)下的規(guī)定。
(3)電泳 垂直板電泳：恒壓電泳，初始電壓為80V，進(jìn)入分離膠時(shí)調(diào)至150～200V，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移膠底處，停止電泳。
(4)用卡尺或用掃描定位法測(cè)量溴酚藍(lán)指示劑和蛋白遷移距離（如為圓盤電泳還應(yīng)測(cè)量染色前后膠條長(zhǎng)度，垂直板電泳膠片厚度低于1mm，染色前后膠片長(zhǎng)度基本不變）。計(jì)算相相對(duì)遷移率:分子量 以R'<[m]>為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得供試品的分子量。;純度 取膠片（條），置薄層掃描儀，以峰面積按歸一化法計(jì)算;結(jié)果判斷 供試品主成分遷移率應(yīng)與對(duì)照品遷移率一致。
電泳緩沖液的作用是什么
緩沖液在電泳過(guò)程中的作用是維持合適的pH。電泳時(shí)的正極與負(fù)極都會(huì)發(fā)生電解反應(yīng)，正極發(fā)生的是氧化反應(yīng)，負(fù)極發(fā)生的是還原反應(yīng)。長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿。一個(gè)好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強(qiáng)的緩沖能力，是溶液兩極的pH保持基本不變。
電泳緩沖液的另一個(gè)作用是使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應(yīng)含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時(shí)電泳速度變慢；太高時(shí)就會(huì)造成過(guò)大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化。
電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA（乙二胺四乙酸），加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時(shí)激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。
此外，我們常常用“電泳法”判斷液體的性質(zhì)，是膠體還是溶液。在高中化學(xué)中我們就用過(guò)這種方法判斷給定的液體是否為膠體。
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